中藥川芎指紋圖譜的相似性研究

1 前言
　　1.1 中藥指紋圖譜
　　國外關于植物藥色譜指紋圖譜的研究論文日漸增多。他們提出的色譜指紋圖鑒別，目的是解決成分復雜、有效成分不明的草藥在生產加工的檢測和證明產品批間質量的穩定。美國FDA允許草藥保健品申報資料可以提供色譜指紋圖譜。WHO在2000年草藥評價指導原則中已有規定，如在植物藥的制備及成品的章節中提到，如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產品質量一致[1-4]。
　　一直以來，我國的中藥研究，大多追隨國外的研究方法，側重于藥用成分的發現和分離。但是，中藥是協同作用的復雜體系（藥效必須通過其內在多種成分相輔相成的作用才能發揮出來），這意味著簡單的把當中的某種成分提取出來進行質量檢測，不能達到評價其藥效的目的[5]。我們需要把中藥內在的信息全面地、綜合地反映出來，而體現系統性、特征性和穩定性三大原則的指紋圖譜正是符合了這個要求。

　　1.2 相似性評價方法
　　中藥指紋圖譜我們可以通過色譜等分析儀器獲得。但是，如果評價不同批次的中藥指紋間的差異的方法不科學，指紋圖譜對中藥質量控制的作用就難以發揮。本研究的目的是探究現今的廣泛應用的相似性評價方法對中藥指紋相似性評價時存在的問題。
　　目前研究中藥指紋圖譜常采用的方法，如投影法、向量夾角余弦（點積）法、相關系數法[8]。先做如下定義，一個中藥的指紋為一個向量X（或Y），向量的元素是中藥中各個成分。即 或者 ，其中n為共有成分的數目。
　　1.2.1 向量余弦法
　　向量余弦法是根據幾何學多維空間的向量夾角的啟發，把兩個指紋當作兩個向量，計算起夾角余弦相似度：

　　1.2.2 簡單相關系數
　　相關系數與變量單位無關，對各特征變量值上的大小不敏感，忽略了變量值大小之間的差異, 變量值的大小差異對特征變量的變化模式影響不大，它是測度樣品間在特征變量的變化模式上相似形狀的相似性，又稱為形狀測度，是鑒別樣品真偽，提供定性信息的相似度：

　　1.2.3 主成分分析
　　主成分分析應用一種降維的思想，把每個指紋圖譜看作一個多維的向量，用線性代數的數學方法計算出每個向量在第一第二主軸上的得分，再用其做出PCA圖，圖上每一個點代表一個指紋圖譜，從PCA點的分布狀況，可以直觀地分辨出各個指紋之間的異同。但這個方法也有其不足之處，再本文中有所討論。

　　2 實驗內容
　　2.1 川芎藥材
　　本次實驗的三批川芎藥材從民用藥房中購買，產地分別為四川，廣東，江西。所得川芎藥材為褐色片狀，磨粉后過40目標準篩，所得樣品粉末按產地分別用玻璃瓶裝好，避光存放備用。
　　2.2 樣品制備
　　稱取0.500g川芎粉末，置于至10.0m容量瓶，用甲醇（AR，廣州試劑廠）定容，35攝氏度下超聲萃取18分鐘。所得溶液過0.20微米濾膜，直接進樣。
　　2.3實驗儀器
　　Agilent（HP）1100高效液相色譜儀：四元低壓梯度泵；二極管陣列檢測器（中山大學中心實驗室提供）
　　2.4 色譜條件
　　色譜柱： Kromsil C18 反相色譜柱，0.5*25*4.6 mm i.d
　　流動相： 流動相A 為0.5％乙酸水溶液（怡寶蒸餾水）；流動相B 為甲醇（分析純）
　　流動梯度：0―3min 32%B ; 3－20min 32－65%B ; 20－36min 65－85%B; 36－48min 85－100%B ; 48－60min 100%B
　　流速： 0.8 mL/min
　　柱溫： 30. 0℃
　　觀測波長：294 nm
　　進樣量： 20μL（進樣閥自動控制）
　　單次測量時間： 60min
　　2.5 實驗方案
　　三個產地的川芎粉末分別取兩次樣品，每個樣品連續進五針（一個實驗日完成），共得到同一制備條件下的30（2×5×3）個川芎指紋圖譜。

　　3．結果與討論
　　3.1 川芎指紋圖譜
　　3.1.1 重現性
　　按文獻[8]報道，川芎藥材的提取液存放8小時后，阿魏酸會發生變化；因此樣品的測量嚴格控制在制樣后8小時內完成。每個實驗日制備一個樣品，連續進樣5針，15個共有峰的RSD 在5％以內；保留時間變化在1min之內，符合指紋圖譜要求。
　　同樣實驗條件下，使兩個實驗日相隔一星期，合拼實驗結果，得到共有峰的RSD在5％以內。
　　3.1.2 精密度
　　三產地的川芎樣品在相同的色譜測量條件下，連續進樣5針，得指紋圖譜共有峰的RSD在5％以內；連續做兩個實驗日，共10針，15個共有峰的峰面積的RSD也在5％以內。
　　3.1.3 指紋圖譜
　　3.2 相似性分析
　　3.2.1相似系數分析
　　各產地10個指紋圖譜取平均值，運用公式1.1和1.2進行向量余弦法分析和相關系數，得到四川，廣東和江西三個產地兩兩比較的相似系數，如表Ⅱ。
　　從余弦系數比較中可以看出，不同產地之間的川芎之間：廣東和四川兩個產地的川芎的相似系數偏離不大，為0. 977和0.969，可以認為沒有顯著性差異；而江西川芎與四川和廣東兩地之間的差異較大，兩個系數值在0.8左右。
　　3.2.2 主成分分析
　　我們把30 個川芎的指紋圖譜數據，每個指紋圖譜作為一個向量，用PCA法分析，得投影圖圖Ⅱ。從PCA 圖中可以看出，30個指紋數據分為3個集中點，分別代表三個產地。證明PCA 作圖分析能形象地展示出各個色譜指紋之間的差異。而從三個聚集區域的距離可以看出，江西川芎和其他兩個地區的川芎有較大的差異。
　　3.3結果討論
　　從實驗的數據來看，運用高效液相色譜法能為中藥川芎的指紋圖譜建立提供穩定、可靠的數據。我們的討論重點放在化學計量學上各種相似性的研究方法的可行性上。從上面的夾角余弦法法，簡單相關系數法以及主成分分析（PCA）中，我們都能成功地把三個產地的川芎區分開來，得到比較一致的結論。下面我們探討一下這些方法在指紋圖譜相似性評價中的存在問題：
　　一．這些方法雖然都能把各個產地之間川芎的差異性表示出來（前三個方法運用數字化的指標，而PCA 法有直觀的圖像），但是，它們無法對這些異同給出一個統計學上的評價，即究竟差異多大才能判斷兩個中藥的圖譜之間存在顯著性的差異。
　　二．內在的一致性的問題。這些分析方法對于同一產地川芎在重復測試當中存在的差異性無法評價。我們以四川川芎10個指紋圖譜為例說明這個問題。圖Ⅲa是四川川芎獨立做PCA 分析的投影圖，表Ⅲ是這10個指紋的相似系數。
　　從圖中可以看出，十個樣品分布比較均勻，但也存在一定的線性趨向，而且兩個實驗日所做所測量的點被清晰地分為1-5以及6-10兩排。PCA圖說明這10個點之間是存在差異的，但是相似系數計算分析不到它們之間的差異，見表Ⅲ。
　　這說明, 這些統計學方法無法告知我們這些差異有多大，更加無法知道它們差異到達何種程度才可以下結論說兩個點（每個點代表一個指紋）之間存在了顯著性的差異。我們分析廣東和江西兩地的川芎指紋時也出現同樣的情況（圖Ⅲb，Ⅲc）。

　　結論：
　　本文建立用液相HPLC方法建立了川芎指紋圖譜，通過向量余弦、相關系數和主成分分析法，研究了三個產地的川芎樣品間的差異。并探討了在研究相似性方面這三個方法的不足。
　　從三個產地各自的PCA投影圖中，我們看出在各產地內部的10個指紋間也存在差異，甚至可以把兩個實驗日所做的指紋區分開來（特別是四川和江西的投影圖）。但是，無論是向量余弦法，相似系數法或PCA投影圖分析，都難以為我們提供一個數據評價這些差異究竟有多大。
　　在這三個方法中，主成分分析（PCA）把指紋圖譜與矢量相接合，并以降維手段把指紋圖譜之間的異同直觀地用圖形表達出來，為中藥指紋圖譜的相似性研究提供了方向，但它難以應用到工業生產中。而向量余弦和相關系數給出的數字難以給出判斷差異性存在的標準指標，也難以評價同一樣品內部一致性。這些方法并不是建立中藥指紋圖譜方面的最有價值的方法，國家在中草藥指紋圖譜建設計劃中急須建立一套有效的方法，科學地評價出指紋圖譜間的差異。