中藥川芎指紋圖譜的相似性研究

1 前言
　　1.1 中藥指紋圖譜
　　國(guó)外關(guān)于植物藥色譜指紋圖譜的研究論文日漸增多。他們提出的色譜指紋圖鑒別，目的是解決成分復(fù)雜、有效成分不明的草藥在生產(chǎn)加工的檢測(cè)和證明產(chǎn)品批間質(zhì)量的穩(wěn)定。美國(guó)FDA允許草藥保健品申報(bào)資料可以提供色譜指紋圖譜。WHO在2000年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中已有規(guī)定，如在植物藥的制備及成品的章節(jié)中提到，如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量一致[1-4]。
　　一直以來(lái)，我國(guó)的中藥研究，大多追隨國(guó)外的研究方法，側(cè)重于藥用成分的發(fā)現(xiàn)和分離。但是，中藥是協(xié)同作用的復(fù)雜體系（藥效必須通過(guò)其內(nèi)在多種成分相輔相成的作用才能發(fā)揮出來(lái)），這意味著簡(jiǎn)單的把當(dāng)中的某種成分提取出來(lái)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，不能達(dá)到評(píng)價(jià)其藥效的目的[5]。我們需要把中藥內(nèi)在的信息全面地、綜合地反映出來(lái)，而體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性三大原則的指紋圖譜正是符合了這個(gè)要求。

　　1.2 相似性評(píng)價(jià)方法
　　中藥指紋圖譜我們可以通過(guò)色譜等分析儀器獲得。但是，如果評(píng)價(jià)不同批次的中藥指紋間的差異的方法不科學(xué)，指紋圖譜對(duì)中藥質(zhì)量控制的作用就難以發(fā)揮。本研究的目的是探究現(xiàn)今的廣泛應(yīng)用的相似性評(píng)價(jià)方法對(duì)中藥指紋相似性評(píng)價(jià)時(shí)存在的問(wèn)題。
　　目前研究中藥指紋圖譜常采用的方法，如投影法、向量夾角余弦（點(diǎn)積）法、相關(guān)系數(shù)法[8]。先做如下定義，一個(gè)中藥的指紋為一個(gè)向量X（或Y），向量的元素是中藥中各個(gè)成分。即 或者 ，其中n為共有成分的數(shù)目。
　　1.2.1 向量余弦法
　　向量余弦法是根據(jù)幾何學(xué)多維空間的向量夾角的啟發(fā)，把兩個(gè)指紋當(dāng)作兩個(gè)向量，計(jì)算起夾角余弦相似度：

　　1.2.2 簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)
　　相關(guān)系數(shù)與變量單位無(wú)關(guān)，對(duì)各特征變量值上的大小不敏感，忽略了變量值大小之間的差異, 變量值的大小差異對(duì)特征變量的變化模式影響不大，它是測(cè)度樣品間在特征變量的變化模式上相似形狀的相似性，又稱為形狀測(cè)度，是鑒別樣品真?zhèn)�，提供定性信息的相似度�?/FONT>

　　1.2.3 主成分分析
　　主成分分析應(yīng)用一種降維的思想，把每個(gè)指紋圖譜看作一個(gè)多維的向量，用線性代數(shù)的數(shù)學(xué)方法計(jì)算出每個(gè)向量在第一第二主軸上的得分，再用其做出PCA圖，圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)指紋圖譜，從PCA點(diǎn)的分布狀況，可以直觀地分辨出各個(gè)指紋之間的異同。但這個(gè)方法也有其不足之處，再本文中有所討論。

　　2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
　　2.1 川芎藥材
　　本次實(shí)驗(yàn)的三批川芎藥材從民用藥房中購(gòu)買，產(chǎn)地分別為四川，廣東，江西。所得川芎藥材為褐色片狀，磨粉后過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩，所得樣品粉末按產(chǎn)地分別用玻璃瓶裝好，避光存放備用。
　　2.2 樣品制備
　　稱取0.500g川芎粉末，置于至10.0m容量瓶，用甲醇（AR，廣州試劑廠）定容，35攝氏度下超聲萃取18分鐘。所得溶液過(guò)0.20微米濾膜，直接進(jìn)樣。
　　2.3實(shí)驗(yàn)儀器
　　Agilent（HP）1100高效液相色譜儀：四元低壓梯度泵；二極管陣列檢測(cè)器（中山大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供）
　　2.4 色譜條件
　　色譜柱： Kromsil C18 反相色譜柱，0.5*25*4.6 mm i.d
　　流動(dòng)相： 流動(dòng)相A 為0.5％乙酸水溶液（怡寶蒸餾水）；流動(dòng)相B 為甲醇（分析純）
　　流動(dòng)梯度：0―3min 32%B ; 3－20min 32－65%B ; 20－36min 65－85%B; 36－48min 85－100%B ; 48－60min 100%B
　　流速： 0.8 mL/min
　　柱溫： 30. 0℃
　　觀測(cè)波長(zhǎng)：294 nm
　　進(jìn)樣量： 20μL（進(jìn)樣閥自動(dòng)控制）
　　單次測(cè)量時(shí)間： 60min
　　2.5 實(shí)驗(yàn)方案
　　三個(gè)產(chǎn)地的川芎粉末分別取兩次樣品，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)五針（一個(gè)實(shí)驗(yàn)日完成），共得到同一制備條件下的30（2×5×3）個(gè)川芎指紋圖譜。

　　3．結(jié)果與討論
　　3.1 川芎指紋圖譜
　　3.1.1 重現(xiàn)性
　　按文獻(xiàn)[8]報(bào)道，川芎藥材的提取液存放8小時(shí)后，阿魏酸會(huì)發(fā)生變化；因此樣品的測(cè)量嚴(yán)格控制在制樣后8小時(shí)內(nèi)完成。每個(gè)實(shí)驗(yàn)日制備一個(gè)樣品，連續(xù)進(jìn)樣5針，15個(gè)共有峰的RSD 在5％以內(nèi)；保留時(shí)間變化在1min之內(nèi)，符合指紋圖譜要求。
　　同樣實(shí)驗(yàn)條件下，使兩個(gè)實(shí)驗(yàn)日相隔一星期，合拼實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到共有峰的RSD在5％以內(nèi)。
　　3.1.2 精密度
　　三產(chǎn)地的川芎樣品在相同的色譜測(cè)量條件下，連續(xù)進(jìn)樣5針，得指紋圖譜共有峰的RSD在5％以內(nèi)；連續(xù)做兩個(gè)實(shí)驗(yàn)日，共10針，15個(gè)共有峰的峰面積的RSD也在5％以內(nèi)。
　　3.1.3 指紋圖譜
　　3.2 相似性分析
　　3.2.1相似系數(shù)分析
　　各產(chǎn)地10個(gè)指紋圖譜取平均值，運(yùn)用公式1.1和1.2進(jìn)行向量余弦法分析和相關(guān)系數(shù)，得到四川，廣東和江西三個(gè)產(chǎn)地兩兩比較的相似系數(shù)，如表Ⅱ。
　　從余弦系數(shù)比較中可以看出，不同產(chǎn)地之間的川芎之間：廣東和四川兩個(gè)產(chǎn)地的川芎的相似系數(shù)偏離不大，為0. 977和0.969，可以認(rèn)為沒(méi)有顯著性差異；而江西川芎與四川和廣東兩地之間的差異較大，兩個(gè)系數(shù)值在0.8左右。
　　3.2.2 主成分分析
　　我們把30 個(gè)川芎的指紋圖譜數(shù)據(jù)，每個(gè)指紋圖譜作為一個(gè)向量，用PCA法分析，得投影圖圖Ⅱ。從PCA 圖中可以看出，30個(gè)指紋數(shù)據(jù)分為3個(gè)集中點(diǎn)，分別代表三個(gè)產(chǎn)地。證明PCA 作圖分析能形象地展示出各個(gè)色譜指紋之間的差異。而從三個(gè)聚集區(qū)域的距離可以看出，江西川芎和其他兩個(gè)地區(qū)的川芎有較大的差異。
　　3.3結(jié)果討論
　　從實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)來(lái)看，運(yùn)用高效液相色譜法能為中藥川芎的指紋圖譜建立提供穩(wěn)定、可靠的數(shù)據(jù)。我們的討論重點(diǎn)放在化學(xué)計(jì)量學(xué)上各種相似性的研究方法的可行性上。從上面的夾角余弦法法，簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)法以及主成分分析（PCA）中，我們都能成功地把三個(gè)產(chǎn)地的川芎區(qū)分開(kāi)來(lái)，得到比較一致的結(jié)論。下面我們探討一下這些方法在指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)中的存在問(wèn)題：
　　一．這些方法雖然都能把各個(gè)產(chǎn)地之間川芎的差異性表示出來(lái)（前三個(gè)方法運(yùn)用數(shù)字化的指標(biāo)，而PCA 法有直觀的圖像），但是，它們無(wú)法對(duì)這些異同給出一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的評(píng)價(jià)，即究竟差異多大才能判斷兩個(gè)中藥的圖譜之間存在顯著性的差異。
　　二．內(nèi)在的一致性的問(wèn)題。這些分析方法對(duì)于同一產(chǎn)地川芎在重復(fù)測(cè)試當(dāng)中存在的差異性無(wú)法評(píng)價(jià)。我們以四川川芎10個(gè)指紋圖譜為例說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題。圖Ⅲa是四川川芎獨(dú)立做PCA 分析的投影圖，表Ⅲ是這10個(gè)指紋的相似系數(shù)。
　　從圖中可以看出，十個(gè)樣品分布比較均勻，但也存在一定的線性趨向，而且兩個(gè)實(shí)驗(yàn)日所做所測(cè)量的點(diǎn)被清晰地分為1-5以及6-10兩排。PCA圖說(shuō)明這10個(gè)點(diǎn)之間是存在差異的，但是相似系數(shù)計(jì)算分析不到它們之間的差異，見(jiàn)表Ⅲ。
　　這說(shuō)明, 這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法無(wú)法告知我們這些差異有多大，更加無(wú)法知道它們差異到達(dá)何種程度才可以下結(jié)論說(shuō)兩個(gè)點(diǎn)（每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)指紋）之間存在了顯著性的差異。我們分析廣東和江西兩地的川芎指紋時(shí)也出現(xiàn)同樣的情況（圖Ⅲb，Ⅲc）。

　　結(jié)論：
　　本文建立用液相HPLC方法建立了川芎指紋圖譜，通過(guò)向量余弦、相關(guān)系數(shù)和主成分分析法，研究了三個(gè)產(chǎn)地的川芎樣品間的差異。并探討了在研究相似性方面這三個(gè)方法的不足。
　　從三個(gè)產(chǎn)地各自的PCA投影圖中，我們看出在各產(chǎn)地內(nèi)部的10個(gè)指紋間也存在差異，甚至可以把兩個(gè)實(shí)驗(yàn)日所做的指紋區(qū)分開(kāi)來(lái)（特別是四川和江西的投影圖）。但是，無(wú)論是向量余弦法，相似系數(shù)法或PCA投影圖分析，都難以為我們提供一個(gè)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)這些差異究竟有多大。
　　在這三個(gè)方法中，主成分分析（PCA）把指紋圖譜與矢量相接合，并以降維手段把指紋圖譜之間的異同直觀地用圖形表達(dá)出來(lái)，為中藥指紋圖譜的相似性研究提供了方向，但它難以應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。而向量余弦和相關(guān)系數(shù)給出的數(shù)字難以給出判斷差異性存在的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，也難以評(píng)價(jià)同一樣品內(nèi)部一致性。這些方法并不是建立中藥指紋圖譜方面的最有價(jià)值的方法，國(guó)家在中草藥指紋圖譜建設(shè)計(jì)劃中急須建立一套有效的方法，科學(xué)地評(píng)價(jià)出指紋圖譜間的差異。