DNA指紋圖譜技術及其在中藥研究中的應用
http://www.dcyhziu.cn 2007/6/19 源自:互聯(lián)網 【字體：
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從20 世紀50年代DNA雙螺旋學說的提出到60年代基因學說的出現(xiàn),從70年代DNA限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)到80年代PCR技術的出現(xiàn),分子生物學發(fā)展迅猛。基因工程等生物新技術的不斷出現(xiàn)和發(fā)展,為人們研究解決問題提供了新的思路和方法。分子生物學技術迅速被應用到醫(yī)學、農學、分類學、法醫(yī)學等許多領域,并取得了巨大成就。近年來,中醫(yī)藥工作者將分子生物學理論和技術引入到自己的研究領域,并取得了令人矚目的成果,對中醫(yī)藥學的現(xiàn)代化進程產生了積極的推動作用。
1 DNA 指紋圖譜的概念
核苷酸序列是生命有機體構建、維持和繁殖生命所必需的遺傳信息。不同種生物體含有不同的DNA序列,同種生物體既有相同的DNA序列,保持同種生物體的遺傳性狀,又具有多態(tài)性,這種多態(tài)性可以是個體、種屬或變異等引起的,它使得同種生物中的各個體千差萬別,生物多樣性正是由于其基因多態(tài)性的結果。由于這種核苷酸序列是相對穩(wěn)定的,因而可以利用現(xiàn)代分子生物學技術構建DNA指紋圖。如將生物體DNA模板進行PCR擴增,不同生物體得到的DNA 片段的大小、數(shù)目不同,再將這種擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果顯示的DNA 帶型差異在紫外下成像,從而得到DNA指紋圖。DNA指紋圖譜具有高度的個體特異性。在分子水平上檢測基因多態(tài)性,比形態(tài)、組織和化學水平上檢測更能代表其變異類的遺傳標記,其鑒別結果更加準確可靠。DNA指紋技術靈敏度高,如果選擇合適的擴增引物,其結果的重復性也非常好。
2 DNA 指紋圖譜的建立
國外在70 年代發(fā)展起來的DNA片斷分析技術——限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP) 在許多領域都有成功的應用,也常用于構建中藥DNA指紋圖譜。限制性內切酶能高度專一地識別和切割DNA序列,不同酶識別不同的DNA序列,因此可利用內切酶的酶解產生不同長度的DNA片段,從而揭示DNA序列水平上的多態(tài)性。酶解后的分子量大小不同的DNA可通過凝膠電泳來分離,再將已分離的DNA 與放射性核試驗素或熒光標記的核酸探針分子雜交,便可獲得信息量大、分辨率高的DNA指紋圖。
但目前人們已普遍感到RFLP方法技術步驟繁瑣,費時費力,應用不便。自80年代中期PCR技術誕生以來,因其操作簡便、不需使用同位素、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,迅速被應用于相關領域。從常規(guī)PCR發(fā)展而來的應用隨意引物擴增的隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(Radon Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 或稱任意引物PCR(arbitrarily Primer PCR ,AP2PCR) 解決了未知特異DNA 序列基因組的擴增問題,它采用任意順序的引物擴增基因組DNA,可以在不知道特異DNA序列的情況下,檢測DNA的多態(tài)性。RAPD技術目前廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構建,在目前絕大多數(shù)藥用動植物DNA序列還未知的情況下,RAPD技術具有廣闊的應用前景。PCR技術的誕生使目的基因極易獲得,再與RFLP 聯(lián)用,還產生了PCR-RFLP、RAPD-RFLP 等方法。RAPD技術的一般步驟如下。
2.1 DNA 提取、純化與檢測 總DNA提取常采用Doyle等的CTAB法,或作適當改進。稱取0.5～1g的新鮮或干燥葉片或根組織,置小研缽中,加入液氮迅速研磨成粉末,轉移到小離心管中,立即加入預熱60℃的CTAB提取液(含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP、β-硫基乙醇等),60℃水浴1h或65℃水浴40min,用等體積的氯仿:異戊醇(CI ,24:1) 抽提,離心;取上層水相,加1/10體積的10%CTAB/0.7mol/LNaCl溶液,輕輕混勻,再加入等體積的CI(24 :1)抽提,離心;取上層水相加入2/3體積預冷的乙醇或異丙醇沉淀DNA,離心,取DNA沉淀,用75%左右的乙醇洗滌2～3 次,干燥后溶于TE 溶液(pH8.0) 中,用RNA 酶酶解或用玻璃奶法純化,得DNA 樣品。將DNA 樣品在018 %瓊脂糖凝膠上進行電泳,檢測DNA片段的長度并估測DNA的濃度。
2.2 PCR 反應 24μL 的PCR 反應體系包括:5μmol/L的引物,2μL ,2mmol/L dNTPslμL ,10×buffer (含20mmol/L 1Mg-Cl2) 2.5μL ,5u/μL Taq DNA 聚合酶0.2μL ,10ng/μL模板DNA 2μL 和滅菌雙蒸水17.3μL 。PCR 反應程序為:94 ℃5min ,37℃1min ,72℃ 2min ,此程序2個循環(huán)后接94℃ 1min ,36℃1min ,72℃ 2min ,38 個循環(huán)后接72℃ 10min。每個引物均以2μL 滅菌雙蒸水作對照。
2.3 PCR 擴增產物的檢測 PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB)上電泳,電泳結果在透射式紫外燈下觀察并照相。
2.4 數(shù)據(jù)分析 電泳圖譜中的每一條帶均為一個分子標記,代表在DNA模板上有一個引物結合位點,不同的樣本在凝膠上泳動距離相同則表示它們有相同的位點。可用二元數(shù)據(jù)(1 ,0) 統(tǒng)計來表示帶的有無,用RAP Distance 軟件進行數(shù)據(jù)輸入,計算樣品間的遺傳距離,然后用NTSYS-pc 軟件進行聚類分析,用UPGMA 法作聚類圖。
90 年代Zabean及Vos等發(fā)明、發(fā)展了一種高效檢測DNA 多態(tài)性的新方法,稱為擴增片段長度多態(tài)性DNA(Ampli-
fied Fragment Length Polymorphism ,AFLP)。該方法用一人工接頭(adapter) 與限制酶切的基因組DNA片段連接,制成AFLP模板DNA,合成一系列3′2末端隨機改變數(shù)個堿基的PCR 引物進行PCR 特異條件的擴增,經電泳分離檢測后可得到DNA指紋圖譜。一次實驗可檢測約50～100個擴增產物,與RFLP、RAPD比較,AFLP 法構建的DNA 指紋圖譜具有效率高、重復性好、靈敏度高的優(yōu)點,而且所檢測到的大多數(shù)擴增片斷與基因組的單一位置對應,展示了AFLP 技術特別適合品種鑒定的應用價值和廣闊前景。
3 DNA 指紋圖譜在中藥研究中的應用
DNA 指紋圖譜技術是在分子水平上、以藥材基因型特征為鑒定指標的一種新技術,它直接分析遺傳物質本身,是分析生物的基因型而非表現(xiàn)型,排除了環(huán)境因素給藥材鑒定帶來的干擾,也不受樣品形態(tài)(藥材原植物、飲片或粉末) 和材料來源的影響,比傳統(tǒng)的方法(性狀、顯微、化學、理化鑒定) 更準確可靠,它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種) ,而且可以檢測外型極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學型乃至個體之間的DNA 的細微變異。這一技術近年來正越來越廣泛地被應用于中藥研究中。
3.1 中藥鑒別 中藥材真?zhèn)舞b別及品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術在中藥研究中應用最多的一個領域。目前藥材市場上還大量存在不同替代品混用的現(xiàn)象,不同地區(qū)同名異物入藥,或是緊俏藥材使用其近緣植物入藥,甚至使用其它偽品假冒名貴藥材。盡管藥材在干燥過程中DNA有所降解,但干品仍然帶有足夠多的DNA 信息特別是穩(wěn)定的小分子帶,可供鑒別藥材使用,因此,不論新鮮藥材還是干品飲片,或是不同藥用部位,通過DNA指紋圖譜技術皆能準確予以鑒別。近年來這方面的研究較多,如人參、西洋參的鑒別,西洋參及其偽品的鑒別,人參不同栽培品種鑒定,山參、園參與西洋參指紋圖鑒別,厚樸及其偽品的鑒別,大黃正偽品的鑒別,不同產地牛蒡子DNA 指紋圖譜鑒別,金銀花品種鑒定等等。
3.2 道地藥材品質評價與中藥材GAP的實施 中藥材的質量除了與藥材特定的生長環(huán)境和特殊的采收加工技術有關外,還與該藥材產區(qū)內這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關,這就是藥材的“道地性”。但以前對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學、藥理學方面。通過DNA 分子手段和化學、藥理學手段結合對道地藥材進行研究,并進一步對遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關系進行研究,能更好地對道地藥材、名優(yōu)藥材進行品質評價,這對指導道地藥材的科學栽培、飼養(yǎng)和藥用優(yōu)良品種的
選育具有重要意義。通過對道地藥材DNA 指紋的認定,還可提供劃分藥材檔次的分子標記。同時,由于國家正在實施中藥材GAP,而實施GAP的基礎是保證藥材引種的準確性,在此DNA指紋圖譜更體現(xiàn)出它的技術優(yōu)勢和重要意義,以及廣闊的應用前景。政府有關部門應適時建立相應的種質鑒定機構, 將DNA 指紋圖譜技術轉化為生產力,這將有力地促進中藥材生產的標準化、產業(yè)化和現(xiàn)代化。
3.3 動、植物中藥種質資源研究與遺傳育種 DNA 指紋圖譜應用于中藥研究的一個重要意義在于揭示了化學成分變化的遺傳本質。每一種中藥材,由于遺傳背景不同,其產生的次生代謝產物也不同,化學多樣性是包含在遺傳多樣性之中的。研究表明,化學成分的變化與DNA 多態(tài)有極強的關聯(lián)性,甚至認為DNA指紋可以作為定量的化學標示。當然,除了遺傳因素,中藥化學成分的種類及其含量與其生長環(huán)境、采收加工等也是密切相關的。
在中藥材的種質資源開發(fā)利用中,基因多態(tài)性是一種寶貴的財富。對于遺傳多樣性水平較低的品種,應盡可能獲得更多的變異類型,可在自然界中尋找、收集變異植珠,或通過分子生物技術手段增加其自然變異率,如體細胞克隆變異、γ或UV射線致突變、原生質體培養(yǎng)等方法。DNA 指紋技術可用于藥材個體或群體的變異觀察。分析這些變異類型的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平,對藥材的選種有重要意義。通過DNA指紋技術分析藥材不同品種的遺傳關系及其差異性,可為藥效學相關基因和抗病基因的定位提供重要信息,推動藥材遺傳育種的進程,如山參與栽培園參的雜交育種,同時為今后分離有價值的藥用動植物目的基因打好基礎,并為構建藥用動植物基因庫提供資料。重要動植物基因的克隆,對中藥保護和資源利用有重要意義。建立中藥材尤其是瀕危藥用動植物和我國特有物種的DNA 指紋圖譜,可使我們更好地從遺傳多樣性上保護中藥的基因資源,防止資源流失。利用轉基因技術,可以有目的地改變某些中藥的成分,從中獲得高效而廉價的抗病組分,轉基因技術目前已用于培植高效、特效中藥材方面。國外也正利用分子生物學技術增加銀杏的自然變異率,以提高銀杏內酯的變異性。
3.4 中藥復方制劑質量控制 目前中藥復方制劑運用DNA指紋圖譜技術進行質量控制的研究和報道少見,原因可能由于很多復方中成藥制劑中總DNA含量極少,有的在生產過程中已被作為雜質處理掉,從復方成藥中提取純化DNA很困難。但在部分含有藥材原粉的中成藥制劑中,由于其藥材總DNA的破壞程度相對較小,而DNA 指紋圖譜技術如RAPD只需微量的總DNA便可進行研究,因此筆者認為,DNA指紋圖譜技術對這些含藥材原粉的復方成藥制劑也有較為實際的用途。
1 DNA 指紋圖譜的概念
核苷酸序列是生命有機體構建、維持和繁殖生命所必需的遺傳信息。不同種生物體含有不同的DNA序列,同種生物體既有相同的DNA序列,保持同種生物體的遺傳性狀,又具有多態(tài)性,這種多態(tài)性可以是個體、種屬或變異等引起的,它使得同種生物中的各個體千差萬別,生物多樣性正是由于其基因多態(tài)性的結果。由于這種核苷酸序列是相對穩(wěn)定的,因而可以利用現(xiàn)代分子生物學技術構建DNA指紋圖。如將生物體DNA模板進行PCR擴增,不同生物體得到的DNA 片段的大小、數(shù)目不同,再將這種擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果顯示的DNA 帶型差異在紫外下成像,從而得到DNA指紋圖。DNA指紋圖譜具有高度的個體特異性。在分子水平上檢測基因多態(tài)性,比形態(tài)、組織和化學水平上檢測更能代表其變異類的遺傳標記,其鑒別結果更加準確可靠。DNA指紋技術靈敏度高,如果選擇合適的擴增引物,其結果的重復性也非常好。
2 DNA 指紋圖譜的建立
國外在70 年代發(fā)展起來的DNA片斷分析技術——限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP) 在許多領域都有成功的應用,也常用于構建中藥DNA指紋圖譜。限制性內切酶能高度專一地識別和切割DNA序列,不同酶識別不同的DNA序列,因此可利用內切酶的酶解產生不同長度的DNA片段,從而揭示DNA序列水平上的多態(tài)性。酶解后的分子量大小不同的DNA可通過凝膠電泳來分離,再將已分離的DNA 與放射性核試驗素或熒光標記的核酸探針分子雜交,便可獲得信息量大、分辨率高的DNA指紋圖。
但目前人們已普遍感到RFLP方法技術步驟繁瑣,費時費力,應用不便。自80年代中期PCR技術誕生以來,因其操作簡便、不需使用同位素、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,迅速被應用于相關領域。從常規(guī)PCR發(fā)展而來的應用隨意引物擴增的隨機擴增多態(tài)性DNA 標記(Radon Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 或稱任意引物PCR(arbitrarily Primer PCR ,AP2PCR) 解決了未知特異DNA 序列基因組的擴增問題,它采用任意順序的引物擴增基因組DNA,可以在不知道特異DNA序列的情況下,檢測DNA的多態(tài)性。RAPD技術目前廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構建,在目前絕大多數(shù)藥用動植物DNA序列還未知的情況下,RAPD技術具有廣闊的應用前景。PCR技術的誕生使目的基因極易獲得,再與RFLP 聯(lián)用,還產生了PCR-RFLP、RAPD-RFLP 等方法。RAPD技術的一般步驟如下。
2.1 DNA 提取、純化與檢測 總DNA提取常采用Doyle等的CTAB法,或作適當改進。稱取0.5～1g的新鮮或干燥葉片或根組織,置小研缽中,加入液氮迅速研磨成粉末,轉移到小離心管中,立即加入預熱60℃的CTAB提取液(含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP、β-硫基乙醇等),60℃水浴1h或65℃水浴40min,用等體積的氯仿:異戊醇(CI ,24:1) 抽提,離心;取上層水相,加1/10體積的10%CTAB/0.7mol/LNaCl溶液,輕輕混勻,再加入等體積的CI(24 :1)抽提,離心;取上層水相加入2/3體積預冷的乙醇或異丙醇沉淀DNA,離心,取DNA沉淀,用75%左右的乙醇洗滌2～3 次,干燥后溶于TE 溶液(pH8.0) 中,用RNA 酶酶解或用玻璃奶法純化,得DNA 樣品。將DNA 樣品在018 %瓊脂糖凝膠上進行電泳,檢測DNA片段的長度并估測DNA的濃度。
2.2 PCR 反應 24μL 的PCR 反應體系包括:5μmol/L的引物,2μL ,2mmol/L dNTPslμL ,10×buffer (含20mmol/L 1Mg-Cl2) 2.5μL ,5u/μL Taq DNA 聚合酶0.2μL ,10ng/μL模板DNA 2μL 和滅菌雙蒸水17.3μL 。PCR 反應程序為:94 ℃5min ,37℃1min ,72℃ 2min ,此程序2個循環(huán)后接94℃ 1min ,36℃1min ,72℃ 2min ,38 個循環(huán)后接72℃ 10min。每個引物均以2μL 滅菌雙蒸水作對照。
2.3 PCR 擴增產物的檢測 PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB)上電泳,電泳結果在透射式紫外燈下觀察并照相。
2.4 數(shù)據(jù)分析 電泳圖譜中的每一條帶均為一個分子標記,代表在DNA模板上有一個引物結合位點,不同的樣本在凝膠上泳動距離相同則表示它們有相同的位點。可用二元數(shù)據(jù)(1 ,0) 統(tǒng)計來表示帶的有無,用RAP Distance 軟件進行數(shù)據(jù)輸入,計算樣品間的遺傳距離,然后用NTSYS-pc 軟件進行聚類分析,用UPGMA 法作聚類圖。
90 年代Zabean及Vos等發(fā)明、發(fā)展了一種高效檢測DNA 多態(tài)性的新方法,稱為擴增片段長度多態(tài)性DNA(Ampli-
fied Fragment Length Polymorphism ,AFLP)。該方法用一人工接頭(adapter) 與限制酶切的基因組DNA片段連接,制成AFLP模板DNA,合成一系列3′2末端隨機改變數(shù)個堿基的PCR 引物進行PCR 特異條件的擴增,經電泳分離檢測后可得到DNA指紋圖譜。一次實驗可檢測約50～100個擴增產物,與RFLP、RAPD比較,AFLP 法構建的DNA 指紋圖譜具有效率高、重復性好、靈敏度高的優(yōu)點,而且所檢測到的大多數(shù)擴增片斷與基因組的單一位置對應,展示了AFLP 技術特別適合品種鑒定的應用價值和廣闊前景。
3 DNA 指紋圖譜在中藥研究中的應用
DNA 指紋圖譜技術是在分子水平上、以藥材基因型特征為鑒定指標的一種新技術,它直接分析遺傳物質本身,是分析生物的基因型而非表現(xiàn)型,排除了環(huán)境因素給藥材鑒定帶來的干擾,也不受樣品形態(tài)(藥材原植物、飲片或粉末) 和材料來源的影響,比傳統(tǒng)的方法(性狀、顯微、化學、理化鑒定) 更準確可靠,它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種) ,而且可以檢測外型極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學型乃至個體之間的DNA 的細微變異。這一技術近年來正越來越廣泛地被應用于中藥研究中。
3.1 中藥鑒別 中藥材真?zhèn)舞b別及品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術在中藥研究中應用最多的一個領域。目前藥材市場上還大量存在不同替代品混用的現(xiàn)象,不同地區(qū)同名異物入藥,或是緊俏藥材使用其近緣植物入藥,甚至使用其它偽品假冒名貴藥材。盡管藥材在干燥過程中DNA有所降解,但干品仍然帶有足夠多的DNA 信息特別是穩(wěn)定的小分子帶,可供鑒別藥材使用,因此,不論新鮮藥材還是干品飲片,或是不同藥用部位,通過DNA指紋圖譜技術皆能準確予以鑒別。近年來這方面的研究較多,如人參、西洋參的鑒別,西洋參及其偽品的鑒別,人參不同栽培品種鑒定,山參、園參與西洋參指紋圖鑒別,厚樸及其偽品的鑒別,大黃正偽品的鑒別,不同產地牛蒡子DNA 指紋圖譜鑒別,金銀花品種鑒定等等。
3.2 道地藥材品質評價與中藥材GAP的實施 中藥材的質量除了與藥材特定的生長環(huán)境和特殊的采收加工技術有關外,還與該藥材產區(qū)內這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關,這就是藥材的“道地性”。但以前對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學、藥理學方面。通過DNA 分子手段和化學、藥理學手段結合對道地藥材進行研究,并進一步對遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關系進行研究,能更好地對道地藥材、名優(yōu)藥材進行品質評價,這對指導道地藥材的科學栽培、飼養(yǎng)和藥用優(yōu)良品種的
選育具有重要意義。通過對道地藥材DNA 指紋的認定,還可提供劃分藥材檔次的分子標記。同時,由于國家正在實施中藥材GAP,而實施GAP的基礎是保證藥材引種的準確性,在此DNA指紋圖譜更體現(xiàn)出它的技術優(yōu)勢和重要意義,以及廣闊的應用前景。政府有關部門應適時建立相應的種質鑒定機構, 將DNA 指紋圖譜技術轉化為生產力,這將有力地促進中藥材生產的標準化、產業(yè)化和現(xiàn)代化。
3.3 動、植物中藥種質資源研究與遺傳育種 DNA 指紋圖譜應用于中藥研究的一個重要意義在于揭示了化學成分變化的遺傳本質。每一種中藥材,由于遺傳背景不同,其產生的次生代謝產物也不同,化學多樣性是包含在遺傳多樣性之中的。研究表明,化學成分的變化與DNA 多態(tài)有極強的關聯(lián)性,甚至認為DNA指紋可以作為定量的化學標示。當然,除了遺傳因素,中藥化學成分的種類及其含量與其生長環(huán)境、采收加工等也是密切相關的。
在中藥材的種質資源開發(fā)利用中,基因多態(tài)性是一種寶貴的財富。對于遺傳多樣性水平較低的品種,應盡可能獲得更多的變異類型,可在自然界中尋找、收集變異植珠,或通過分子生物技術手段增加其自然變異率,如體細胞克隆變異、γ或UV射線致突變、原生質體培養(yǎng)等方法。DNA 指紋技術可用于藥材個體或群體的變異觀察。分析這些變異類型的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平,對藥材的選種有重要意義。通過DNA指紋技術分析藥材不同品種的遺傳關系及其差異性,可為藥效學相關基因和抗病基因的定位提供重要信息,推動藥材遺傳育種的進程,如山參與栽培園參的雜交育種,同時為今后分離有價值的藥用動植物目的基因打好基礎,并為構建藥用動植物基因庫提供資料。重要動植物基因的克隆,對中藥保護和資源利用有重要意義。建立中藥材尤其是瀕危藥用動植物和我國特有物種的DNA 指紋圖譜,可使我們更好地從遺傳多樣性上保護中藥的基因資源,防止資源流失。利用轉基因技術,可以有目的地改變某些中藥的成分,從中獲得高效而廉價的抗病組分,轉基因技術目前已用于培植高效、特效中藥材方面。國外也正利用分子生物學技術增加銀杏的自然變異率,以提高銀杏內酯的變異性。
3.4 中藥復方制劑質量控制 目前中藥復方制劑運用DNA指紋圖譜技術進行質量控制的研究和報道少見,原因可能由于很多復方中成藥制劑中總DNA含量極少,有的在生產過程中已被作為雜質處理掉,從復方成藥中提取純化DNA很困難。但在部分含有藥材原粉的中成藥制劑中,由于其藥材總DNA的破壞程度相對較小,而DNA 指紋圖譜技術如RAPD只需微量的總DNA便可進行研究,因此筆者認為,DNA指紋圖譜技術對這些含藥材原粉的復方成藥制劑也有較為實際的用途。
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