【摘要】 目的 建立苦參素氯化鈉注射液中苦參素含量及有關物質檢測的高效液相色譜方法。方法 HypersilC18(5μm，4.6mm×200mm)色譜柱;流動相：三乙胺磷酸緩沖液(pH 7.2)-乙腈(80：20);流速1ml/min，檢測波長λ210nm。取三批試藥單點外標法測定苦參素含量，歸一化法測定制劑中有關物質的含量。結果 苦參素濃度在12～1200μg/ml范圍內，峰面積(A)與濃度(C)線性良好，回歸方程為(A)=15262759C+24440(r=0.9999)。日內日間RSD<1%，平均回收率為100.6%。三批樣品的含量分別為102.9%、102.4%和102.2%，三批樣品有關物質的含量分別為0.31、0.31、0.32。結論 可以應用HPLC測定苦參素氯化鈉注射液中苦參素的含量和有關的物質，該方法準確度和精密度高，檢測限低，適合應用于該制劑的質量控制。
【關鍵詞】 苦參素氯化鈉注射液；高效液相色譜法；含量；有關物質
The study of quality about the injection of kurarinone and sodium chloride
【Abstract】 Objective To use liquid chromatograghy(LC)，and to detect the content of kurarinone and correlative matter in the injection of kurarinone and sodium chloride.Methods Chromatograghic column was Hypersil C18(5μm.4.6mm×200mm);mobile phase were the buffer solution of triethylamine phosphoric acid (pH 7.2);acetenitrile(80：20)，flow rate 1ml/min and detection wavelength was 210nm. To use extiernal standard method，detected the content of kurarinone in the three groups of reagent，detected the content of the correlative matter in the reagent with normalized method. Results We found that the content of kuarinoe was 12～1200μg/ml，peak area(a). concentration(c)and linear regression were favorable， regression equation was A=15262759c+24440(r=0.9999)，and RSD<1.in a day or next，the everage recovery was 100.6%， the econtent of kurarinone in the three groups of reagent were 102.9%，102.4% and 102.2%，the content of the correlative matter in the three groups of reagent were 0.31，0.31，and 0.32.Conclusion The study shows that we can detect the content of the kurarinone and correlative matter in the injection of kurarinone and sodium chloride with HPLC， The methods has very good accuracy and precision， it is suitable for the quality control of the reagent， with low detection limit.
【Key words】 kurarinone sodium chloride injection;high-performance liquid chromatography(HPLC);content;correlalive matter
苦參素(Oxymatrine)是從中藥苦豆子中提取的生物堿，98%為氧化苦參堿，具有抗炎、抗菌、抗病毒、調節機體免疫功能等生物化學作用［1］。臨床應用的苦參素氯化鈉注射液為每瓶250ml，含0.2g苦參素和2.25g氯化鈉，每次用3瓶，液體用量較大，靜點時間較長，為了滿足臨床的需要開發了每瓶100ml，含苦參素0.6g和氯化鈉0.9g的新制劑，從 而減少了臨床應用次數和輸液量，且縮短了靜脈點滴時間。在參考國內文獻基礎上［2］，本實驗建立了測定制劑中苦參素含量及有關物質的HPLC方法， 該測定方法為制劑的質量研究提供參考。
1 儀器和試藥
1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(600E泵，712自動進樣品，996PDA檢測器，在線脫氧機，Millenium色譜管理系統)。
1.2 試藥 苦參素氯化鈉注射液(規格100ml含苦參堿0.6g，氯化鈉9g；批號：020621、020622、02623；生產廠家：哈爾濱康信藥物技術開發有限公司)；苦參素對照品(黑龍江省藥品檢定所提供);乙腈為色譜純，磷酸、三乙胺為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件 色譜柱：HyperSilC18(5μm，4.6mm×200mm)柱；流動相：三乙胺磷酸緩沖（三乙胺１０ml溶于800ml水中，用磷酸調pＨ至7.2，再加水至1000ml）：乙腈（８０：２０v／v）;檢測波：λ210nm;流速１ml/min;進樣量２０μl。
2.2 系統適應性 分別取流動相，苦參素氯化鈉注射液及苦參素對照品適量，流動相溶解并稀釋得稀釋溶液，另取苦參素原料適量兩份，其中1份加6mol/L硝酸0.5ml，另1份加1mol/L氫氧化鈉0.5ml，分別于60℃水浴４h后，用流動相稀釋２０倍，得苦參素酸、堿破壞稀釋溶液。取上述溶液２０μl進樣，色譜分離，結果苦參素的保留時間為6.353min，流動相無干擾峰，酸破壞后降解產物與苦參素分離良好，分離度＞1.5，見圖1。 a 空白溶液；b 苦參素對照品；c 苦參素氯化鈉注射液； d 酸破壞稀釋溶液；e 堿破壞稀釋溶液；1 苦參素 圖1 系統適應性色譜圖
2.3 線性實驗 精密稱取干燥恒重的苦參素的對照品３０mg，置２５ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度搖勻，得濃度為１.２mg/ml的溶液，用流動相逐級稀釋使苦參素的濃度分別為0.24、0.12、0.048、0.024和0.012mg/ml的系列溶液，分別精密量以上溶液20μl，按上述色譜條件進樣，進行色譜分離，以峰面積（A）對濃度（C）進行回歸，得回歸方程為A＝1526275C+24440(r=0.9999，P<0.05)。結果表明苦參素濃度在0.012～0.24mg/ml范圍內濃度與峰面積的線性關系良好。
2.4 最小檢測限 取“2.3”項下濃度為0.012mg/ml的溶液，逐級稀釋，進樣20μl，按上述色譜條件進行分離，以信噪比優于3：1為有效色譜峰，結果表明苦參素的最小檢測限為2.6ng。
2.5 溶液穩定性 取“2.3”項下濃度為0.12mg/ml的溶液，分別與0、1、3、5、7、10、15和20h進樣20μl，按上述條件進行色譜分離，結果20h內溶液穩定，濃度為（0.12±0.047）mg/ml，RSD為0.39%。
2.6 精密度實驗 取苦參素對照品適量，置于100ml容量瓶中，按處方量加入氯化鈉和超純水，分別制備苦參素處方標示量的80%、100%和120%三個濃度供試液。每個濃度制備5份，即，分別每日5次和每日1次連續5天制備，取上述各溶液20μl進樣，色譜分離紀錄色譜峰，將色譜峰帶入線性方程計算側得值，計算精密度，結果RSD＜1%，見表1。 表1 密度實驗結果
2.7 回收率實驗 按“2.5”方法制備標示含量為80%、100%、120%的三個濃度溶液5份，按上述色譜方法進樣20μl，進行色譜分離，得色譜峰（A），將色譜峰代入線性方程計算側得值，以側得值/加入值×100%計算回收率，結果回收率在97%～103%范圍內，見表2。表2 回收率實驗結果
2.8 含量測定 取恒重的苦參素對照品適量，精密稱量，加流動相稀釋，制備苦參素濃度為0.12mg/ml的溶液作為對照品溶液。另精密量取苦參素氯化鈉注射液2ml，置100ml容量瓶當中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，按上述色譜條件，對照品和供試品色譜峰，按外標法計算苦參素的標示量百分含量。對三批苦參素氯化鈉注射液，每批10瓶進行含量測定。結果三批樣品（020621、020622、020623）的含量分別為（102.9±0.87）%、（102.4±0.85）%、（102.2±1.89）%，見表3。表3 三批樣品含量測定結果
2.9 有關物質測定 分別取三批苦參素氯化鈉注射液，每批10瓶，每瓶精密量取2ml，置于10ml容量瓶中加流動相至刻度，搖勻，得有關物質測定的供試液。在再精密量取上述供試液1ml取于50ml容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，作對照溶液。精密量取20μl，按上述色譜條件進行分離。調整儀器靈敏度，使供試液主峰的峰高約為滿量程的20%～40%，用歸一化法計算除試藥外各有效峰的百分含量，以各有效峰的百分含量總和計算有關物質含量，另外各有關物質峰面積的總和不得大于對照溶液的峰面積，即有關物質含量＜2%。結果表明三批樣品（020621、020622、020623）的有關物質分別為（0.31±0.022）%、（0.33±0.025）%、（0.34±0.029）%，均＜2%，見表4，圖2。 圖2 有關物質測定色譜圖a 空白溶液；b 有關物質測定的供試液；c 有關物質測定的對照溶液 表4 三批樣品有關物質含量
3 討論
氧化苦參堿(oxymatrine)是從豆科槐屬植物苦豆子及苦參根中提取分離得到的一種雙稠哌啶衍生物，現代藥理學研究表明它有強心、抗心律失常、抗炎抗腫瘤等作用，近年來它還被用于治療乙型肝炎，取得良好的效果，臨床上廣泛用于治療因腫瘤放療、化療引起的白細胞減少和慢性乙肝等［3］。通過對溶劑、提取次數、堿化條件的選擇，用離子交換和重結晶的方法提取純化氧化苦參堿。其工藝為60％的酒精提取、沉淀、濃縮、酸化后上柱交換，已交換的樹脂堿化后用氯仿萃取，收干氯仿后用乙醚萃取，沉淀用丙酮結晶得氧化苦參堿。苦參素為氧化苦參堿和氧化槐果堿的混合物，其中氧化苦參堿的含量在98%以上，苦參素質量標準中的含量測定多采用硫酸滴定薄層掃描等方法繁項，其含量雜質無法計算［4］。
我們曾在預試驗中探索應用氨基柱、C8柱等，均未得滿意的分離效果。這樣應用十八基硅烷硅膠未填充劑的ＯＤＳ柱（Ｃ１８），三乙胺磷酸緩沖液（pＨ 7.2）-乙腈（80：20，v／v）為流動相，氧化苦參堿色譜峰的柱效＞4000，有關物質的分離度1.5。通過研究證實，流動相的酸堿度對氧化苦參堿色譜峰的保留時間及分離度影響大，所以在應用此方法對氧化苦參堿制劑進行含量及有關物質分析時要加以注意。該方法適合應用于苦參素氯化鈉注射液質量標準研究中苦參素的含量測定及該制劑有關物質測定，且該方法精密度、準確度和靈敏度較高。為苦參素制劑的質量標準研究提供了參考的較好的分析方法。
【參考文獻】
1 施光輝，李謙，翁心華，等.苦參素對犬鼠纖維化肝臟金屬蛋白酶-1和平滑肌肌動蛋白表達的影響.中華肝臟病雜志，2004，12（1）：56-59.
2 丁青龍，惲宏偉.復方苦參堿的含量測定及穩定性研究.藥學實踐雜志，2005，23（1）：20-21.
3 李丹，王平金，張楠森.苦參堿類生物堿的研究進展及臨床應用.中草藥，1996，27（5）：308-309.
4 楊紅兵，彭松.薄層掃描法測定芪山抗癌較囊中苦參堿的含量.湖北中醫學，2003，24（2）：201-203.
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