中國(guó)人肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者蛋白基因缺失的研究

關(guān)鍵詞：肌營(yíng)養(yǎng)不良;基因;缺失 

　　摘要:目的 了解中國(guó)人Duchenne和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者基因缺失情況。 方法 用覆蓋dystrophin cD-NA全長(zhǎng)56.3%的5個(gè)dystrophin cDNA探針檢測(cè)41名無親緣關(guān)系的DMD/BMD患者。 結(jié)果 22名（54%）患者存在基因突變，其中DMD患者的檢出率為56.7%:BMD患者的檢出率為45%。21名患者存在基因缺失，占檢出數(shù)的95.45%。 結(jié)論 缺失主要分布在cDNA8檢測(cè)區(qū)，其次在cDNA1-2a檢測(cè)區(qū)。
　　
　　關(guān)鍵詞:肌營(yíng)養(yǎng)不良;基因;缺失
　　
　　Study on the gene deletion in patients with Duchenne muscular dystrophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）.
　　　　Abstract:Objective To investigate the circumstances of gene deletion of Chinese patients with Duchnne’s type muscular dys-trophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）. Methods Circumstances of gene deletions in41unrelated DMD and BMD patients were studied by using a32-p-dCTP labeled dystrophin cDNA probe（1-2a，4-Sa，Sb-7，8and9）covering56.3%of dystrophin full-length cDND. Results Gene mutation was observed in22patients accounted for56.3%，the DMD detection rate was56.7%and BMD detection rate was45.0%.Gene deletion wasoccurred to21patients accounted for95.45%of the total de-tected. Conclusion The hot point of gene deletion in DMD patients was mainly distributed in the cDNA8region（exon47～52and followed by the cDNA1～2a region（exon1～9）.The deletion was not evenly distributed involving different exons and extent.
　　
　　Key words:Muscular dystrophy;Gene;Deletion
　　　　
　　Duchenne和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD/BMD）是我國(guó)最常見的與X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病，發(fā)病率約1/3300活男嬰 ［1］ 。該病系肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin）基因突變所致 ［2，8］ 。DMD患者在2～3歲出現(xiàn)肌無力，漸發(fā)展成不能行走，12歲開始依賴輪椅，20歲左右常因呼吸衰竭死亡;BMD患者臨床癥狀較緩和，大多在15歲以后的某個(gè)時(shí)期依賴輪椅，但有的直到60歲仍能行走 ［1］ 。
　　1 對(duì)象和方法
　　
　　1.1 研究對(duì)象 41名無親緣關(guān)系的DMD/BMD患兒標(biāo)本隨機(jī)收集自解放軍總醫(yī)院肌病門診。其中DMD患者30名，年齡在2～23歲;BMD患者11名，年齡在12～38歲。根據(jù)進(jìn)行性肌萎縮、肌無力，腓腸肌假性肥大，家族史，血清CK值顯著增高，肌電圖呈肌源性損害，肌活檢示肌肉壞死、變性、再生、結(jié)締組織增生等特征確診患者。取5名正常女性標(biāo)本作為對(duì)照。
　　1.2 方法 實(shí)驗(yàn)所用dystrophin cDNA探針菌種購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。采用堿變性法抽提質(zhì)粒DNA ［3］ ，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和/或HindⅢ酶切質(zhì)粒，電泳分別回收5個(gè)探針片段:cDNA 1-2a ，cDNA 4-5a ，cDNA 5b-7 ，cDNA 8 和cDNA 9 。隨機(jī)引物法將α-32p-dCTP（Amer-sham）標(biāo)記于cDNA探針上 ［4］ 。按Smith方法制備白細(xì)胞DNA ［5］ ，用HindⅢ完全酶解后于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳36～48h，再經(jīng)Southern印跡將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜（Hybond  TM -N+，Amersham）上，固定后置于預(yù)雜交液中（0，5M Na-PO 4 pH7.2，7%SDS，0.1%鮭魚精DNA，lmM EDTA），65℃預(yù)雜交3h，加入變性后的探針繼續(xù)于65℃雜交12h ［6］ 。-70℃放射自顯影3～7d，沖片后分析結(jié)果。
　　
　　2 結(jié)果
　　
　　用覆蓋dystrophin全長(zhǎng)56.3%的上述5個(gè)cDNA探針，從41名病人中檢出22例有基因突變，占全部患者的53.66%。其中DMD病人17名，占DMD病人的56.7%（17/30）;BMD病人5名，占其患者數(shù)的45.4%（5/11）。22例基因突變中，21例為基因缺失，另1例為存在一異常的連接片段，其具體突變類型未被檢出。如表1所示。
　　3 討論
　　
　　3.1 缺失突變 從表1中看到，21例缺失不規(guī)則地分布在cDNA檢測(cè)區(qū)。缺失相對(duì)集中在兩個(gè)區(qū)域:cD-NA 8 檢測(cè)區(qū)（15例，占71%）和cDNA 1-2a 檢測(cè)區(qū)（5例，占24%）。cDNA 5b-7 和cDNA 9 檢出的9例缺失中，有8例缺失區(qū)延伸至cDNA 8 檢測(cè)區(qū)。這種缺失區(qū)分布特征與國(guó)外大綜報(bào)道一致 ［7］ 。
　　
　　缺失所累及的外顯子數(shù)目不一，或?yàn)橐粋�(gè)，或達(dá)28個(gè)。每個(gè)外顯子受累頻度亦不相同，或?yàn)?次，或?yàn)?3次（48號(hào)外顯子），見表1。外顯子受累頻率為PCR檢測(cè)患者提供了參考依據(jù)。
　　表1 41例DMD/BMD患者的缺失情況（略）
　　Tab1 Deletions Of41DMD/BMD Patients
　　
　　*注:本組患者中共有21例患者存在缺失突變。Note:21cases with deletion mutations.
　　　　
　　Dystrophin基因位于Xp21區(qū)帶，長(zhǎng)達(dá)2300Kb，是迄今所知最長(zhǎng)的一個(gè)基因 ［8］ 。該基因外顯子9-60之間有26個(gè)同源順序，它們?cè)阪⒚萌旧�體分裂過程中較容易發(fā)生染色體內(nèi)同源順序重組，造成同源順序間的DNA丟失 ［7］ 。由于同源順序多，分布廣泛，同源順序重組致使DNA斷裂點(diǎn)多，缺失位置和范圍不定，可以解釋DMD/BMD患者dystrophin基因內(nèi)形式多樣的缺失突變。
　　3.2 根據(jù)整碼缺失部位推測(cè)dystrophin基因的關(guān)鍵區(qū) 移碼突變致使外顯子缺失及與其相連的外顯子遺傳密碼的變化，影響到dystrophin的半胱氨酸富集區(qū)和C末端，從而根據(jù)移碼突變不易判定dystrophin的關(guān)鍵區(qū)段。而通過分析整碼缺失則有可能達(dá)到此目的。如表2對(duì)患者臨床表型、起病年齡和整碼缺失區(qū)域進(jìn)行對(duì)比分析后，我們推測(cè)dystrophin基因的關(guān)鍵區(qū)之一位于50和51號(hào)外顯子。從表2中看到，外顯子整碼缺失較少的12號(hào)和19號(hào)患者，發(fā)病早于缺失數(shù) 較多的8號(hào)、10號(hào)和11號(hào)患者。前者1～2歲發(fā)病，累及50～51號(hào)外顯子，后者4～6歲發(fā)病，未累及這兩個(gè)外顯子。另2例BMD患者（1和4號(hào)患者）外顯子整碼缺失個(gè)數(shù)相同，均為3個(gè)，分別累及3～5號(hào)和47～49號(hào)外顯子。而后者發(fā)病較早（13歲），可能說明47～49號(hào)外顯子編碼的氦基酸序列較重要，這與它們同關(guān)鍵的50～51號(hào)外顯子相連，并協(xié)助50～51號(hào)外顯子發(fā)揮功能有關(guān)。
　　
　　表2 整碼缺失突變與臨床表現(xiàn)的關(guān)系（略）
　　　　
　　Tab2 The relation of In-frame deletions and clinical representations
　　3.3 其它突變類型 本組尚有19例患者（占46.3%）未被檢出dystrophin基因組DNA/HindⅢ片段的異常。用cDNA雜交檢測(cè)的方法，分辨率在400bp以上，故不可能發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)的微小突變及點(diǎn)突變。部分探針（cDNA 2b-3，10-14 ）未進(jìn)行檢測(cè)，亦遺漏了部分基因突變的檢出。據(jù)報(bào)道，dystrophin基因突變類型尚有重復(fù)突變、易位、基因內(nèi)到位、及影響mRNA后加工的內(nèi)含子的突變 ［9］ 。
　　參考文獻(xiàn):
　　
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