關鍵詞：肌營養不良;基因;缺失
摘要:目的 了解中國人Duchenne和Becker型肌營養不良癥患者基因缺失情況。 方法 用覆蓋dystrophin cD-NA全長56.3%的5個dystrophin cDNA探針檢測41名無親緣關系的DMD/BMD患者。 結果 22名（54%）患者存在基因突變，其中DMD患者的檢出率為56.7%:BMD患者的檢出率為45%。21名患者存在基因缺失，占檢出數的95.45%。 結論 缺失主要分布在cDNA8檢測區，其次在cDNA1-2a檢測區。
關鍵詞:肌營養不良;基因;缺失
Study on the gene deletion in patients with Duchenne muscular dystrophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）.
Abstract:Objective To investigate the circumstances of gene deletion of Chinese patients with Duchnne’s type muscular dys-trophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）. Methods Circumstances of gene deletions in41unrelated DMD and BMD patients were studied by using a32-p-dCTP labeled dystrophin cDNA probe（1-2a，4-Sa，Sb-7，8and9）covering56.3%of dystrophin full-length cDND. Results Gene mutation was observed in22patients accounted for56.3%，the DMD detection rate was56.7%and BMD detection rate was45.0%.Gene deletion wasoccurred to21patients accounted for95.45%of the total de-tected. Conclusion The hot point of gene deletion in DMD patients was mainly distributed in the cDNA8region（exon47～52and followed by the cDNA1～2a region（exon1～9）.The deletion was not evenly distributed involving different exons and extent.
Key words:Muscular dystrophy;Gene;Deletion
Duchenne和Becker型肌營養不良癥（DMD/BMD）是我國最常見的與X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病，發病率約1/3300活男嬰 ［1］ 。該病系肌營養不良蛋白（dystrophin）基因突變所致 ［2，8］ 。DMD患者在2～3歲出現肌無力，漸發展成不能行走，12歲開始依賴輪椅，20歲左右常因呼吸衰竭死亡;BMD患者臨床癥狀較緩和，大多在15歲以后的某個時期依賴輪椅，但有的直到60歲仍能行走 ［1］ 。
1 對象和方法
1.1 研究對象 41名無親緣關系的DMD/BMD患兒標本隨機收集自解放軍總醫院肌病門診。其中DMD患者30名，年齡在2～23歲;BMD患者11名，年齡在12～38歲。根據進行性肌萎縮、肌無力，腓腸肌假性肥大，家族史，血清CK值顯著增高，肌電圖呈肌源性損害，肌活檢示肌肉壞死、變性、再生、結締組織增生等特征確診患者。取5名正常女性標本作為對照。
1.2 方法 實驗所用dystrophin cDNA探針菌種購自美國ATCC公司。采用堿變性法抽提質粒DNA ［3］ ，用限制性內切酶EcoR I和/或HindⅢ酶切質粒，電泳分別回收5個探針片段:cDNA 1-2a ，cDNA 4-5a ，cDNA 5b-7 ，cDNA 8 和cDNA 9 。隨機引物法將α-32p-dCTP（Amer-sham）標記于cDNA探針上 ［4］ 。按Smith方法制備白細胞DNA ［5］ ，用HindⅢ完全酶解后于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳36～48h，再經Southern印跡將DNA轉移至尼龍膜（Hybond TM -N+，Amersham）上，固定后置于預雜交液中（0，5M Na-PO 4 pH7.2，7%SDS，0.1%鮭魚精DNA，lmM EDTA），65℃預雜交3h，加入變性后的探針繼續于65℃雜交12h ［6］ 。-70℃放射自顯影3～7d，沖片后分析結果。
2 結果
用覆蓋dystrophin全長56.3%的上述5個cDNA探針，從41名病人中檢出22例有基因突變，占全部患者的53.66%。其中DMD病人17名，占DMD病人的56.7%（17/30）;BMD病人5名，占其患者數的45.4%（5/11）。22例基因突變中，21例為基因缺失，另1例為存在一異常的連接片段，其具體突變類型未被檢出。如表1所示。
3 討論
3.1 缺失突變 從表1中看到，21例缺失不規則地分布在cDNA檢測區。缺失相對集中在兩個區域:cD-NA 8 檢測區（15例，占71%）和cDNA 1-2a 檢測區（5例，占24%）。cDNA 5b-7 和cDNA 9 檢出的9例缺失中，有8例缺失區延伸至cDNA 8 檢測區。這種缺失區分布特征與國外大綜報道一致 ［7］ 。
缺失所累及的外顯子數目不一，或為一個，或達28個。每個外顯子受累頻度亦不相同，或為1次，或為13次（48號外顯子），見表1。外顯子受累頻率為PCR檢測患者提供了參考依據。
表1 41例DMD/BMD患者的缺失情況（略）
Tab1 Deletions Of41DMD/BMD Patients
*注:本組患者中共有21例患者存在缺失突變。Note:21cases with deletion mutations.
Dystrophin基因位于Xp21區帶，長達2300Kb，是迄今所知最長的一個基因 ［8］ 。該基因外顯子9-60之間有26個同源順序，它們在姊妹染色體分裂過程中較容易發生染色體內同源順序重組，造成同源順序間的DNA丟失 ［7］ 。由于同源順序多，分布廣泛，同源順序重組致使DNA斷裂點多，缺失位置和范圍不定，可以解釋DMD/BMD患者dystrophin基因內形式多樣的缺失突變。
3.2 根據整碼缺失部位推測dystrophin基因的關鍵區 移碼突變致使外顯子缺失及與其相連的外顯子遺傳密碼的變化，影響到dystrophin的半胱氨酸富集區和C末端，從而根據移碼突變不易判定dystrophin的關鍵區段。而通過分析整碼缺失則有可能達到此目的。如表2對患者臨床表型、起病年齡和整碼缺失區域進行對比分析后，我們推測dystrophin基因的關鍵區之一位于50和51號外顯子。從表2中看到，外顯子整碼缺失較少的12號和19號患者，發病早于缺失數 較多的8號、10號和11號患者。前者1～2歲發病，累及50～51號外顯子，后者4～6歲發病，未累及這兩個外顯子。另2例BMD患者（1和4號患者）外顯子整碼缺失個數相同，均為3個，分別累及3～5號和47～49號外顯子。而后者發病較早（13歲），可能說明47～49號外顯子編碼的氦基酸序列較重要，這與它們同關鍵的50～51號外顯子相連，并協助50～51號外顯子發揮功能有關。
表2 整碼缺失突變與臨床表現的關系（略）
Tab2 The relation of In-frame deletions and clinical representations
3.3 其它突變類型 本組尚有19例患者（占46.3%）未被檢出dystrophin基因組DNA/HindⅢ片段的異常。用cDNA雜交檢測的方法，分辨率在400bp以上，故不可能發現基因內的微小突變及點突變。部分探針（cDNA 2b-3，10-14 ）未進行檢測，亦遺漏了部分基因突變的檢出。據報道，dystrophin基因突變類型尚有重復突變、易位、基因內到位、及影響mRNA后加工的內含子的突變 ［9］ 。
參考文獻:
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［8］ Koenig M，Hoffman EP，Bertelson CJ，et al.Complete cloning at the Duchenne muscular dystrophy（DMD）eDNA and preliminary genomie orga-nization of the DMD gene in normal and affected individuals［J］.Cell，1987，50:509.
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